प्रीसेल्स का अलगाव-चूहे प्लीहा डेंड्राइटिक कोशिकाएं-कोलेजिनेज पाचन प्लीहा सेल सस्पेंशन तैयार करने के लिए
सहायक कार्यक्रम:
कोलेजनेज़ पाचन द्वारा प्लीहा कोशिका निलंबन की तैयारी
प्रायोगिक सामग्री:
1. 4000U/ml कोलेजनेज़ डी, पिघलाया गया और बर्फ पर रखा गया
2. एचबीएसएस, निष्फल, सीए + , एमजी 2+ युक्त (लाइफ टेक्नोलॉजीज में खरीदा गया)
3. चूहे की तिल्ली
4. हाइपोडर्मिक सुई, 22G × 1 1/2 व्यास (बेक्टन डिकिंसन)
5. 10 मिली, 5 मिली डिस्पोजेबल सिरिंज (जैसे बेक्टन डिकिंसन)
6. 100 मिमी व्यास वाली पेट्री डिश (जैसे फाल्कन)
7. 2 आटोक्लेव का सॉटूथ एनाटॉमी (जैसे रोबोज़)
8. आटोक्लेव्ड स्टेनलेस स्टील जाल: 40-मेश स्टेनलेस स्टील जाल को 5 सेमी × 5 सेमी के छोटे वर्गों में काटें, किनारों को नीचे मोड़ें, और फिर चारों किनारों को एक उथले आयताकार कटोरे में मोड़ें; पन्नी को लपेटा जाता है और आटोक्लेव किया जाता है।
प्रायोगिक विधि:
1. 4000 यू/एमएल कोलेजनेज़ डी (20 प्लीहा के लिए पर्याप्त) के 1 मिलीलीटर की 2 ट्यूब पतला करें: 9 मिलीलीटर एचबीएसएस का 1 मिलीलीटर (4000 यू/एमएल तक पतला, चरण 8), एचबीएसएस के 39 मिलीलीटर का 1 मिलीलीटर (100 यू/एमएल तक पतला)। बर्फ पर रखें.
2. 22G सुई को 100 U/ml कोलेजनेज़ से भरी 10 ml सिरिंज से जोड़ें। 100 मिमी पेट्री डिश में 100 यू/एमएल घोल का 10 मिलीलीटर जोड़ा गया था।
3. ऑपरेशन के लिए एक और 100 मिमी व्यास वाली पेट्री डिश लें। एक हाथ में संदंश, दूसरे हाथ में सिरिंज और पिस्टन पर अंगूठा पकड़ें। चूहे की तिल्ली को संदंश से जकड़ दिया गया था, और तिल्ली कैप्सूल के संकीर्ण किनारे को सुई से छेद दिया गया था, और 100 मिलीलीटर 100 यू / एमएल कोलेजनेज़ इंजेक्ट किया गया था। तिल्ली को सुई की ओर धकेलने के लिए संदंश का उपयोग करें और सुई को कुछ मिलीमीटर आगे बढ़ाएं। कोलेजनेज़ को बार-बार इंजेक्ट किया गया और तब तक जारी रखा गया जब तक कि 1 मिलीलीटर कोलेजनेज़ को प्लीहा में इंजेक्ट नहीं किया गया, और सुई दूसरे छोर से प्लीहा को छेद नहीं देती।
4. तिल्ली को फाड़ने के लिए एक सुई का उपयोग करें और इसे कोलेजनेज़ युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें (चरण 2)। तब तक दोहराएँ जब तक कि सभी तिल्ली इंजेक्ट न हो जाएँ और फट न जाएँ।
5. दूसरे डिश से सेल सस्पेंशन इकट्ठा करें और बर्फ पर रखी 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। डिश को 100 यू/एमएल कोलेजनेज़ के 3 मिलीलीटर से धोया गया और उपरोक्त 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा गया।
6. पेट्री डिश में 3 मिली 100 यू/एमएल कोलेजनेज़ मिलाएं। कटी हुई तिल्ली को बदले में पेट्री डिश में स्थानांतरित किया गया। उन्हें 2 चिमटी से किनारे से 1 मिमी के छोटे टुकड़ों में फाड़ दिया गया ताकि वे 5 मिलीलीटर पिपेट के आंतरिक व्यास से गुजर सकें। सभी तिल्ली के टुकड़े हो जाने के बाद, पहले से तिल्ली के टुकड़ों पर रखे गए पेट्री डिश में कोलेजनेज़ घोल डाला गया और 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ कई बार जोर से उड़ाया गया।
7. पेट्री डिश को झुकाएं, मलबे के बड़े टुकड़ों को हटा दें, और सेल सस्पेंशन को चरण 5 में बर्फ पर रखी 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। डिश को 100 यू/एमएल कोलेजनेज़ के कुछ मिलीलीटर से धोया गया था और एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ा गया था।
8. डिश में बचे तिल्ली के टुकड़ों में 10 मिलीलीटर 400 यू/एमएल कोलेजनेज़ मिलाएं। कई बार पिपेट करने के बाद, 30-90 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
9. ऊष्मायन के अंतिम चरण में, टुकड़ों को तोड़ें और उन्हें 100 मिमी व्यास वाले पेट्री डिश के बाँझ स्टील जाल पर चूसें।
10. स्टेंसिल के एक सिरे को चिमटी से सुरक्षित करें, टुकड़ों को 100 यू/एमएल कोलेजनेज़ के कुछ मिलीलीटर से धोएं, और फिर टुकड़ों को एक बाँझ 5 मिलीलीटर सिरिंज प्लंजर से पीस लें। तब तक तोड़ें जब तक कि टिश्यू से सारा लाल पदार्थ न निकल जाए। स्टील की जाली को 100 यू/एमएल कोलेजनेज़ के कुछ मिलीलीटर से धोया गया था।
11. पेट्री डिश से स्टेंसिल हटा दें और रंगहीन चिपकने वाले कणिकाओं को हटा दें। पेट्री डिश में तरल को तेजी से उड़ाया जाता है और चरण 7 के 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। डिश को 100 यू/एमएल कोलेजनेज़ के कुछ मिलीलीटर के साथ धोया गया था और एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (लगभग 0.5% डेंड्राइटिक कोशिकाएं या उससे कम) में जोड़ा गया था।
12. यदि आवश्यक हो, उच्च घनत्व बीएसए के साथ अपकेंद्रित्र।
परिशिष्ट:
एंटीबॉडी-संयुग्मित भेड़ लाल रक्त कोशिकाएं (ईए):
एकत्रित भेड़ एरिथ्रोसाइट्स के 2.5 मिलीलीटर (अलसेवर समाधान में निकाले गए; कोकालिको) को पीबीएस के साथ 3 बार धोया गया, और प्रत्येक धोने के बाद 5 मिनट के लिए 350 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया गया। फिर इसे ताजा पीबीएस के साथ 5% सेल सस्पेंशन (10 9 सेल/एमएल) तक पतला किया गया। अत्यधिक संवेदनशील खरगोश एंटी-एरिथ्रोसाइट सीरम को 5% सेल सस्पेंशन में 1:50 पतला किया गया था (संभवतः एंटीबॉडी की एक सबग्लूटीनेटेड खुराक बनाई गई थी)। कमरे के तापमान पर 2 घंटे तक सेते रहें और कभी-कभी घोल को धीरे से पलट दें। गठित ईए को आरपीएमआई 1640 (लाइफ टेक्नोलॉजीज) के साथ 3 बार धोया गया था, और फिर ईए को पीबीएस के साथ 5% सेल सस्पेंशन तक पतला किया गया था। 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और उपयोग से पहले आरपीएमआई से एक बार धो लें।
आरपीएमआई-5 पूर्ण माध्यम:
आरपीएमआई1640 माध्यम (लाइफ टेक्नोलॉजीज), जिसमें शामिल हैं:
5% एफबीएस, 1 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रिय
10mmol/L HEPES
20 मिलीग्राम/एमएल जेंटामाइसिन सल्फेट (लाइफ टेक्नोलॉजीज)
50 मिमीओल/एमएल 2-एमई
निस्पंदन बंध्याकरण
उच्च घनत्व बीएसए समाधान:
1 लीटर वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में, 186 मिलीलीटर पीबीएस, 29 मिलीलीटर 1 मोल/एल NaOH, 65 मिलीलीटर पानी डालें (सावधान रहें, तरल पर ध्यान दें और बोतल के अंदर छींटे न डालें)। हिलाएं नहीं, घोल की सतह पर 106 ग्राम बीएसए (कोहन अंश वी, अनुशंसित पूर्ण बीएसए) लगाएं, टिन की पन्नी से ढक दें और बीएसए को धीरे-धीरे घोलने के लिए रात भर ठंडा करें।
अगले दिन, धीरे से हिलाने से एक स्पष्ट, थोड़ा भूरा घोल बन गया; अपवर्तनांक को निकटतम चौथे दशमलव स्थान पर मापा जाता है। बीएसए का सही घनत्व (1.080 ग्राम/एमएल) का 25 डिग्री सेल्सियस पर अपवर्तनांक 1.384 से 1.385 है। अपवर्तक सूचकांक को ठीक करने के बाद, पीएच को एक परीक्षण पेपर से मापा गया। पीएच 7.0 और 7.4 के बीच होना चाहिए और आम तौर पर किसी समायोजन की आवश्यकता नहीं होती है।
बाँझ निस्पंदन समाधान. एक 47 मिमी फिल्टर (मिलपोर प्रकार) को 500 मिलीलीटर फिल्टर इकाई (नलगीन #156-4045) के ऊपर रखा गया था और फिल्टर को बीएसए की थोड़ी मात्रा के साथ गीला किया गया था। जब तक बीएसए फ़िल्टर न हो जाए तब तक कुछ मिनटों के लिए वैक्यूम फ़िल्टर करें। वैक्यूम पंप को हटा दें और शेष बीएसए समाधान को फिल्टर के ऊपरी भाग में जलाशय में सावधानी से जोड़ें (फोमिंग से बचें। शेष बीएसए को फ़िल्टर करने के लिए वैक्यूम पंप और फ़िल्टर का उपयोग करें, ≥ 10 मिनट)। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने तक भंडारित किया जा सकता है।
Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co., Ltd.
