कोलेजनेज़ पाचन विधि - गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का संवर्धन

मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं में उच्च विभेदन क्षमता होती है, स्थिर जीन होते हैं, उत्परिवर्तन के प्रति संवेदनशील नहीं होते हैं, और ट्यूमर का कारण नहीं बनते हैं; उन्हें मिलान और अस्वीकृति की आवश्यकता नहीं होती है, और रोग उपचार और उम्र-विरोधी अनुसंधान में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। वर्तमान में, सौंदर्य उद्योग और उप-स्वास्थ्य समूहों के लिए भी आवेदन अधिक से अधिक ध्यान आकर्षित कर रहा है।

गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की गर्भनाल कैप्सूल, हुआटोंग गम, नाभि शिरा और नाभि धमनी नाभि से बनी होती है। हुआटोंग के मसूड़े में अम्बिलिकल कॉर्ड मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएँ मौजूद होती हैं।
छोटी मात्रा के कारण, कोलेजनेज़ के साथ पाचन के बाद प्राप्त कोशिकाओं की मात्रा कम होती है। इसके अलावा, जब कोलेजन सामान्य कोलेजनेज पाचन विधि द्वारा प्राप्त किया जाता है, तो कोलेजनेज कोशिकाओं के लिए अधिक हानिकारक होता है, और सुसंस्कृत कोशिकाएं खराब स्थिति में होती हैं।

पैच विधि मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल कोशिकाओं को विकसित करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, लेकिन कोशिकाएं लंबे समय (10-20 दिन या उससे भी अधिक) तक ऊतक से बाहर निकलती रहती हैं। निरंतर अन्वेषण के बाद, हमें कोलेजनेज़ पाचन द्वारा गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं प्राप्त करने का एक तरीका मिला।

विशिष्ट संचालन विधि इस प्रकार है:
1 बच्चे की गर्भनाल और मां की गर्भनाल को काटने के बाद, आंतरिक संदूषण को रोकने के लिए तुरंत इसे गर्भनाल क्लैंप से जकड़ें। एक बाँझ बैग (कंटेनर) में लोड करें और प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें।
2 जैव सुरक्षा कैबिनेट में या साफ बेंच में, गर्भनाल को हटा दें और 2 मिनट (50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब या 250 पीएक्स डिश) के लिए 75% अल्कोहल सोख का उपयोग करें। यदि गर्भनाल लंबी है और कंटेनर में लोड नहीं किया जा सकता है, तो गर्भनाल को लगभग 250px तक काटा जा सकता है, लेकिन शराब को गर्भनाल में प्रवेश करने और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए काटने से पहले गर्भनाल क्लैंप को जोड़ा जाना चाहिए।
3 अल्कोहल से उपचार के बाद, इसे जल्दी से पीबीएस या सेलाइन से भरे कंटेनर में 2 बार, हर बार 2 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
4 गर्भनाल क्लिप को काटें, गर्भनाल को 2-75px खंडों में काटें, नाभि शिरा के अंदर से गर्भनाल को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें, और बिच्छू बिच्छू (नाभि रज्जु ऊतक अपेक्षाकृत फिसलन है, बिच्छू बिच्छू को संचालित करने के लिए) का उपयोग नाभि शिरा, गर्भनाल धमनी और गर्भनाल तक करें। विविध कोशिकाओं के समावेश को रोकने के लिए लिफ़ाफ़ा हटा दिया जाता है।
5 गर्भनाल के ऊतकों को कैंची से काटें, 0.1% प्रकार II कोलेजनेज़ (डीएमईएम/एफ12 के साथ पतला घोल) को रात भर पतला करें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पचाएं।
6 अगले दिन, अपचित ऊतक को 100 मेश (80 मेश, 160 मेश) स्टील स्क्रीन (अधिमानतः स्टील मेश स्क्रीन, आसान संचालन के लिए बड़ी मात्रा में टिशू ले जाने वाली) पर डालें, टिशू की सतह से जितना संभव हो उतना कोलेजनेज़ हटाने के लिए पीबीएस (या सलाइन) से कई बार कुल्ला करें। अंत में, पीबीएस (या खारा) को हटाने के लिए पूरे माध्यम से 1-2 बार कुल्ला करें।
7 डिश में डालें (बोतल में डालना असुविधाजनक है), बिना पचे टिश्यू ब्लॉक (6 मिली प्लस 2-3 मिली, 10 मिली प्लस 3-4 मिली) पर मध्यम कल्चर की थोड़ी मात्रा डालें (इसका उद्देश्य कोशिकाओं पर अवशिष्ट कोलेजनेज़ को कम करना है)। अगले दिन, ऊतक ब्लॉक पूरी तरह से गायब हो गया (ऊतक में डूबा हुआ कोलेजनेज़ पच गया), कोशिकाएं पूरी तरह से बिखर गईं, और माइक्रोस्कोप के तहत, पहले से पचे हुए ऊतक में कई बिखरी हुई कोशिकाएं थीं। माध्यम में थोड़ी मात्रा में मीडियम (150 पिक्सल प्लस 2-3 मिली, 250 पिक्सल प्लस 4-5 मिली) मिलाया गया और कल्चर जारी रखा गया।
8 दो दिनों के बाद, थोड़ी मात्रा में मीडियम (150px प्लस 2-3ml, 250px प्लस 4-5ml) मिलाना जारी रखें।
9 एक या दो दिनों के बाद, कोशिकाओं की संख्या में काफी वृद्धि होगी (कई कॉलोनी विकास), दो 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, 50 मिलीलीटर में पीबीएस (या नमकीन) जोड़ें, मिश्रण करें, 2500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, 6 मिनट।
10 पूर्ण माध्यम में 5-6 मिलीलीटर (कोशिकाओं की मात्रा के आधार पर) को पुनः निलंबित करें, 6 मिनट के लिए 1000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, एक टी25 फ्लास्क में रखें, और 5 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम डालें।
13 दिनों के बाद, माध्यम बदलकर या 3-4 मिलीलीटर पूर्ण माध्यम मिलाकर संवर्धन जारी रखा जा सकता है। हर तीन दिनों के बाद, तरल को तब तक बदलें जब तक कि यह खत्म न हो जाए (70% से अधिक तरल पदार्थ के रूप में बाहर निकल सकता है)

रहस्योद्घाटन नोट्स:
1 इस विधि को संचालित करना आसान है और इसका ऊष्मायन समय कम है।
2 कोलेजनेज़ के साथ गर्भनाल का पाचन, 37 डिग्री सेल्सियस पर, गर्भनाल को मूल रूप से कुछ घंटों के भीतर पचाया जा सकता है, लेकिन साथ ही कोशिकाओं को नुकसान अधिक होता है। कोलेजनेज़ गर्भनाल के ऊतकों में प्रवेश कर सकता है, और कोलेजनेज़ की कम सांद्रता ऊतकों को अंदर से बाहर तक पचाती है, जिससे कोशिकाओं को कम नुकसान होता है। (ट्रिप्सिन का गर्भनाल के ऊतकों पर बहुत खराब पाचन प्रभाव पड़ता है)
3 ऊतक को पूरी तरह से पचाने और कोशिकाओं को अलग से अलग न करने का कारण यह है कि नाभि कोलेजन घटक (चिपचिपा) गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देता है। अधिकांश कोशिकाएँ कोलेजन में निलंबित रहती हैं और कालोनियों में बढ़ती रहती हैं, यही मुख्य कारण है कि कोशिकाएँ अच्छी स्थिति में रहती हैं।
4 गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का संवर्धन करते समय, सीरम युक्त माध्यम का उपयोग न करें (सीरम कोशिका विभेदन को बढ़ावा देता है), बल्कि स्टेम सेल-विशिष्ट माध्यम का उपयोग करें। मार्ग में ट्रिप्सिन पाचन (गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को ट्रिप्सिन क्षति) न करने का भी प्रयास किया जाता है, अधिक मार्ग समय सुनिश्चित करने के लिए विशेष पाचक रस का उपयोग किया जाना चाहिए।