रैट कोलेजनेज़ I एलिसा किट के लिए निर्देश मैनुअल

रैट कोलेजनेज़ I एलिसा किट के लिए निर्देश मैनुअल

यह किट केवल इन विट्रो अनुसंधान उपयोग के लिए है, नैदानिक ​​निदान के लिए नहीं!

इच्छित आवेदन

चूहे के सीरम, प्लाज्मा या अन्य संबंधित जैविक तरल पदार्थों में कोलेजनेज़ I की सामग्री को मात्रात्मक रूप से निर्धारित करने के लिए एलिसा विधि का उपयोग किया गया था।

प्रायोगिक सिद्धांत

एक ठोस-चरण वाहक बनाने के लिए माइक्रोवेल प्लेट को शुद्ध कोलेजनेज़ I एंटीबॉडी के साथ कोट करें। सब्सट्रेट (टीएमबी) के साथ रंग विकास को अच्छी तरह से धोने के बाद, माइक्रोवेल्स में बदले में नमूने या मानक, बायोटिनाइलेटेड कोलेजनेज़ I एंटीबॉडी और एचआरपी-लेबल एविडिन जोड़ें। टीएमबी पेरोक्सीडेज के उत्प्रेरण के तहत नीले रंग में और एसिड की कार्रवाई के तहत अंतिम पीले रंग में परिवर्तित हो जाता है। नमूने में रंग की गहराई कोलेजनेज़ I के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है। नमूना एकाग्रता की गणना करने के लिए माइक्रोप्लेट रीडर के साथ 450nm पर अवशोषण (मान) को मापें।

किट संरचना और अभिकर्मक तैयारी

1. माइक्रोप्लेट: एक टुकड़ा (96 कुएं)

2. मानक उत्पाद (लियोफिलाइज्ड उत्पाद): 2 बोतलें, कृपया उपयोग से पहले 15 मिनट के भीतर तैयार करें। प्रत्येक बोतल को नमूना मंदक के साथ 1 मिलीलीटर तक पतला किया जाता है। कैपिंग के बाद, इसे लगभग 10 मिनट तक कमरे के तापमान पर खड़े रहने दिया जाता है। साथ ही घुलने में मदद के लिए इसे बार-बार उलटा/रगड़ा जाता है। इसकी सांद्रता 100 एनजी/एमएल है। प्लेट में एकाधिक तनुकरण करें), और 100 एनजी/एमएल, 50 एनजी/एमएल, 25 एनजी/एमएल, 12.5 एनजी/एमएल, 6.25 एनजी/एमएल, 3.12 एनजी/एमएल, 1.56 एनजी/एमएल तैयार करें, और एक खाली कुएं के रूप में नमूना सीधे 0 एनजी/एमएल पतला करें। उदाहरण के लिए, 50 एनजी/एमएल मानक तैयार करने के लिए: उपरोक्त मानक 100एनजी/एमएल का 0.5 मिलीलीटर (0.5 मिलीलीटर से कम नहीं) लें और इसे 0.5 मिलीलीटर नमूना मंदक वाले एपेंडॉर्फ ट्यूब में जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और शेष एकाग्रता सादृश्य द्वारा निकाली जा सकती है।

3. नमूना मंदक: 1 × 20 मि.ली.

4. परीक्षण तनुकरण ए: 1 × 10 मि.ली.

5. परीक्षण मंदक बी: 1 × 10 मि.ली.

6. डिटेक्शन सॉल्यूशन ए: 1 × 120 प्रति बोतल (1: 100)। उपयोग करने से पहले, टेस्ट डिल्यूएंट ए 1: 100 (जैसे: 10 टेस्ट सॉल्यूशन ए / 990 टेस्ट डिल्यूएंट ए) के साथ पतला करें, अच्छी तरह मिलाएं, और प्रत्येक प्रयोग (100 / होल) के लिए आवश्यक पूर्व-गणना की गई कुल मात्रा के अनुसार तैयार करें, वास्तविक तैयारी के दौरान अधिक 0.1-0.2 मिलीलीटर तैयार किया जाना चाहिए।

7. डिटेक्शन सॉल्यूशन बी: ​​1 × 120 प्रति बोतल (1: 100)। उपयोग से तुरंत पहले परीक्षण तनुकरण बी के साथ 1:100 पतला करें। तनुकरण विधि परीक्षण समाधान ए के समान है।

8. सब्सट्रेट घोल: 1 × 10 मिली/बोतल।

9. सांद्रित धुलाई तरल: 1 × 30 मि.ली./बोतल, प्रत्येक बोतल को आसुत जल से 25 बार पतला किया जाता है।

10. स्टॉप सॉल्यूशन: 1 × 10ml/बोतल (2 mol/L H2SO4)।

11. लेमिनेशन: 5 शीट

12. निर्देश पुस्तिका: 1 प्रति

अपना सामान स्वयं लाएँ

1. माइक्रोप्लेट रीडर (उपयोग से पहले उपकरण को पहले से गरम करने की अनुशंसा की जाती है)

2. माइक्रो डोजिंग डिवाइस और पिपेट टिप, ईपी ट्यूब

3. आसुत या विआयनीकृत जल, फिल्टर पेपर

नमूनों का संग्रहण एवं संरक्षण

1. सीरम: पूरे रक्त के नमूनों को कमरे के तापमान पर 2 घंटे या 4 रात के लिए छोड़ देना चाहिए। 20 मिनट के लिए 1000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला का पता लगाने के लिए लें, या सतह पर तैरनेवाला को -20 या -80 पर संग्रहित करें, लेकिन बार-बार जमने और पिघलने से बचें। .

2. प्लाज्मा: EDTA या हेपरिन का उपयोग थक्कारोधी के रूप में किया जा सकता है। संग्रह के बाद 30 मिनट के भीतर नमूने को 1000 ग्राम पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को पता लगाने के लिए लिया जा सकता है, या सतह पर तैरनेवाला को -20 या -80 पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, लेकिन बार-बार फ्रीज और पिघलना चाहिए।

3. अन्य जैविक नमूने: 20 मिनट के लिए 1000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, परीक्षण के लिए सतह पर तैरनेवाला लें, या सतह पर तैरनेवाला को -20 या -80 पर संग्रहित करें, लेकिन बार-बार जमने और पिघलने से बचें।

ध्यान दें: उपरोक्त नमूनों को सील करके संग्रहीत किया जाना चाहिए, 4 को 1 सप्ताह से कम समय के लिए संग्रहीत किया जाना चाहिए, -20 को 1 महीने से अधिक नहीं होना चाहिए, -80 को 2 महीने से अधिक नहीं होना चाहिए; नमूना हेमोलिसिस अंतिम परीक्षण परिणामों को प्रभावित करेगा, इसलिए हेमोलिसिस नमूनों का परीक्षण नहीं किया जाना चाहिए।

कदम

प्रयोग शुरू करने से पहले, सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर संतुलित किया जाना चाहिए, और अभिकर्मकों को सीधे 37 पर भंग नहीं किया जाना चाहिए; अभिकर्मकों या नमूनों को तैयार करते समय, उन्हें अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए, और मिश्रण करते समय झाग से बचने का प्रयास करें। प्रयोग से पहले नमूना सामग्री की भविष्यवाणी की जानी चाहिए। यदि नमूना सांद्रता बहुत अधिक है, तो पतला नमूना किट की पहचान सीमा को पूरा करने के लिए पतला किया जाना चाहिए, और फिर गणना करते समय संबंधित कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा किया जाना चाहिए।

1. नमूना जोड़ें: परीक्षण के लिए क्रमशः खाली छेद, मानक छेद और नमूना छेद सेट करें। खाली कुएं में 100% नमूना पतला डालें, और शेष कुएं में 100% मानक या परीक्षण किया जाने वाला नमूना डालें। सावधान रहें कि हवा के बुलबुले न हों। नमूना जोड़ते समय एंजाइम प्लेट के नीचे नमूना जोड़ें। कोशिश करें कि कुएं की दीवार को न छुएं। लक्ष्य प्लेट को ढँक दें या ढँक दें और 2 घंटे के लिए 37 पर सेते रहें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रयोगात्मक परिणाम वैध हैं

प्रत्येक प्रयोग के लिए, कृपया एक नए मानक समाधान का उपयोग करें।

2. तरल को फेंक दें और बिना धोए सुखा लें। प्रत्येक कुएं में डिटेक्शन सॉल्यूशन ए (उपयोग से पहले तैयार) के 100 कार्यशील सॉल्यूशन जोड़ें, झिल्ली में माइक्रोप्लेट जोड़ें, और 1 घंटे के लिए 37 पर इनक्यूबेट करें।

3. छेद में तरल पदार्थ डालें, घुमाकर सुखाएं, प्लेट को 3 बार धोएं, हर बार 1-2 मिनट के लिए भिगोएँ, लगभग 400 प्रति छेद, घुमाकर सुखाएँ (आप छेद में मौजूद तरल को थपथपाकर भी सुखा सकते हैं)।

4. प्रत्येक कुएं में परीक्षण समाधान बी (उपयोग से पहले तैयार) का 100% कार्यशील समाधान जोड़ें, एक कोटिंग जोड़ें, और 1 घंटे के लिए 37 पर इनक्यूबेट करें।

5. तरल को छेद में डालें, घुमाकर सुखाएं, प्लेट को 5 बार धोएं, विधि चरण 3 के समान है।

6. रंग विकास से बचने के लिए सब्सट्रेट समाधान 90 प्रति कुएं, एंजाइम लेबल प्लेट और फिल्म 37 जोड़ें (प्रतिक्रिया समय 15-30 मिनट पर नियंत्रित किया जाता है, जब मानक कुओं के पहले 3-4 कुओं में स्पष्ट नीली ढाल होती है, अंतिम 3 - जब 4 कुओं की ढाल स्पष्ट नहीं होती है, तो इसे समाप्त किया जा सकता है)।

7. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में 50% स्टॉप सॉल्यूशन डालें। इस समय नीला रंग पीला हो जाता है। स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ने का क्रम सब्सट्रेट सॉल्यूशन के समान होना चाहिए।

8. 450 एनएम तरंग दैर्ध्य पर माइक्रोप्लेट रीडर के साथ प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व (मान) को तुरंत मापें।

टिप्पणी:

1. अभिकर्मकों की तैयारी: उपयोग से पहले सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर संतुलित किया जाना चाहिए। कृपया उपयोग के तुरंत बाद निर्देशों के अनुसार अभिकर्मकों को सहेजें। क्रॉस संदूषण से बचने के लिए कृपया प्रयोग के दौरान डिस्पोजेबल युक्तियों का उपयोग करें।

2. नमूना जोड़ना: नमूने जोड़ते समय या अभिकर्मकों को जोड़ते समय, यदि पहले कुएं और आखिरी कुएं के बीच का समय अंतराल बहुत बड़ा है, तो इसके परिणामस्वरूप अलग-अलग "पूर्व-ऊष्मायन" समय होगा, जो स्पष्ट रूप से मापा मूल्य सटीकता और दोहराव को प्रभावित करेगा। एक नमूना जोड़ने का समय (मानक और सभी नमूनों सहित) 10 मिनट के भीतर सबसे अच्छा नियंत्रित किया जाता है। प्रयोगों के लिए एकाधिक छेद स्थापित करने की अनुशंसा की जाती है।

3. ऊष्मायन: नमूने को वाष्पित होने से बचाने के लिए, तरल वाष्पीकरण से बचने के लिए प्रयोग के दौरान एंजाइम-लेबल वाली प्लेट को गीले बॉक्स में एक ढक्कन या झिल्ली के साथ रखें; अगला कदम प्लेट धोने के बाद यथाशीघ्र किया जाना चाहिए, और किसी भी समय माइक्रोप्लेट सूखी अवस्था में होने से बचना चाहिए; साथ ही, दिए गए ऊष्मायन समय और तापमान का सख्ती से पालन किया जाना चाहिए।

4. धुलाई: धुलाई प्रक्रिया के दौरान प्रतिक्रिया में बचे हुए धुलाई तरल को फिल्टर पेपर पर थपथपाकर सुखाना चाहिए। पानी सोखने के लिए फिल्टर पेपर को सीधे प्रतिक्रिया कूप में न डालें। साथ ही, अंतिम एंजाइम लेबल उपकरण रीडिंग को प्रभावित करने से बचने के लिए प्लेट के तल पर शेष तरल और उंगलियों के निशान को हटा दिया जाना चाहिए।

5. अभिकर्मकों की तैयारी: उपयोग करने से पहले, ट्यूब की दीवार या बोतल के ढक्कन पर तरल को ट्यूब के नीचे जमा होने से रोकने के लिए कृपया हाथों को कुछ बार हिलाएं या थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। मानक उत्पाद, कार्यशील समाधान ए, और कार्यशील समाधान बी को आवश्यक मात्रा के अनुसार तैयार किया जाना चाहिए, और संबंधित मंदक के साथ तैयार किया जाना चाहिए, भ्रमित न हों। कृपया मानक और कार्यशील समाधान को सटीक रूप से तैयार करें, और गलत कमजोर पड़ने के कारण एकाग्रता त्रुटि से बचने के लिए कम मात्रा में तैयार न करने का प्रयास करें (जैसे कि परीक्षण समाधान ए खींचते समय, यह एक समय में 10 से कम नहीं होना चाहिए); पतला मानक का पुन: उपयोग न करें और समाधान ए कार्यशील तरल पदार्थ का परीक्षण करें, समाधान बी कार्यशील तरल पदार्थ का पता लगाएं।

6. प्रतिक्रिया समय का नियंत्रण: कृपया सब्सट्रेट जोड़ने के बाद नियमित रूप से प्रतिक्रिया के रंग परिवर्तन को अच्छी तरह से देखें (उदाहरण के लिए, हर 10 मिनट में)। यदि रंग गहरा है, तो प्रतिक्रिया को बहुत तेज़ होने और माइक्रोप्लेट रीडर को प्रभावित करने से बचने के लिए प्रतिक्रिया को रोकने के लिए कृपया पहले से ही स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ें। ऑप्टिकल घनत्व पढ़ना।

7. सब्सट्रेट: कृपया सब्सट्रेट को प्रकाश से दूर रखें, और भंडारण और ऊष्मायन के दौरान तेज रोशनी के सीधे संपर्क से बचें।

धोने की विधि

1. मैनुअल प्लेट धोने की विधि: अनुशंसित वॉशिंग बफर के कम से कम 0.4 मिलीलीटर को कुएं में डालें, 1-2 मिनट के लिए भिगोएँ, एस्पिरेट करें (प्लेट की दीवार को न छुएं) या एंजाइम प्लेट में तरल को हिलाएं, और प्रयोगात्मक टेबल पर कुछ परतें डालें। अवशोषक कागज, माइक्रोटिटर प्लेट के साथ नीचे और जोर से कई बार थपथपाएं; आवश्यकतानुसार इस प्रक्रिया को कई बार दोहराएं।

2. स्वचालित प्लेट वाशिंग: यदि कोई स्वचालित प्लेट वाशिंग मशीन है, तो उसे कुशलतापूर्वक उपयोग करने के बाद औपचारिक प्रयोग प्रक्रिया में उपयोग किया जाना चाहिए।

विशेषता

किट एक ही समय में पुनः संयोजक या प्राकृतिक चूहे कोलेजनेज़ I का पता लगा सकती है, और अन्य संबंधित प्रोटीन के साथ इसकी कोई क्रॉस-रिएक्टिविटी नहीं है।

गणना

प्रत्येक मानक और नमूना मान को रिक्त छेद मान (7-बिंदु आरेख) से घटा दिया जाता है। यदि एकाधिक छेद सेट किए गए हैं, तो गणना के लिए औसत मान का उपयोग किया जाना चाहिए। मानक उत्पाद की सांद्रता को कोटि (लघुगणकीय निर्देशांक) के रूप में और मान को भुज (लघुगणकीय निर्देशांक) के रूप में लेते हुए, लघुगणकीय निर्देशांक कागज पर एक मानक वक्र बनाएं। विश्लेषण के लिए पेशेवर वक्र बनाने वाले सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है, जैसे कि वक्र विशेषज्ञ 1.3, नमूना मूल्य के अनुसार, मानक वक्र से संबंधित एकाग्रता का पता लगाएं, और इसे कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करें; या मानक वक्र के प्रतिगमन समीकरण की गणना करने के लिए मानक की एकाग्रता और मूल्य का उपयोग करें, और फिर नमूना का मान समीकरण में प्रतिस्थापित किया जाता है, नमूना एकाग्रता की गणना की जाती है, और फिर कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा किया जाता है, जो नमूने की वास्तविक एकाग्रता है।

डिटेक्शन रेंज: 1.56 एनजी / एमएल-100 एनजी / एमएल, कृपया मानक वक्र खींचने के लिए निम्नलिखित एकाग्रता मान बनाएं: 100 एनजी / एमएल, 50 एनजी / एमएल, 25 एनजी / एमएल, 12.5 एनजी / एमएल, 6.25 एनजी / एमएल, 3.12 एनजी / एमएल, 1.56 एनजी / एमएल।

न्यूनतम पता लगाने की सीमा: 0.78 एनजी/एमएल

स्पष्टीकरण

1. मौजूदा स्थितियों और विज्ञान और प्रौद्योगिकी के स्तर के कारण, सभी आपूर्तिकर्ताओं द्वारा प्रदान किए गए सभी कच्चे माल की व्यापक पहचान और विश्लेषण करना संभव नहीं है।

इस उत्पाद में कुछ गुणवत्ता और तकनीकी जोखिम हो सकते हैं।

2. अंतिम प्रयोगात्मक परिणाम अभिकर्मकों की प्रभावशीलता, प्रयोगकर्ता के प्रासंगिक संचालन और उस समय प्रयोगात्मक वातावरण से निकटता से संबंधित हैं, कृपया सुनिश्चित करें

बैकअप के लिए पर्याप्त नमूने तैयार करें.

3. भंडारण और ऊष्मायन के दौरान अभिकर्मक को तेज रोशनी में उजागर करने से बचें। वाष्पीकरण और माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए सभी अभिकर्मक बोतल के ढक्कन कसकर बंद होने चाहिए, क्योंकि प्रोटियोलिटिक एंजाइमों के हस्तक्षेप से गलत परिणाम होंगे।

4. किट का भंडारण: कृपया किट प्राप्त करने के बाद जितनी जल्दी हो सके मानक, डिटेक्शन सॉल्यूशन ए और डिटेक्शन सॉल्यूशन बी को -20 पर स्टोर करें, और शेष अभिकर्मकों को अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 पर स्टोर करें। खोलने के बाद, माइक्रोप्लेट को शुष्कक से सील कर देना चाहिए और नमी से बचने के लिए -20 पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

5. नमक सांद्रित वाशिंग तरल से अवक्षेपित होगा, जिसे गर्म किया जा सकता है और पतला होने पर पानी के स्नान में घोला जा सकता है।

6. अभी खोले गए एंजाइम-लिंक्ड प्लेट के कुएं में थोड़ा पानी जैसा पदार्थ हो सकता है। यह एक सामान्य घटना है और इसका प्रयोगात्मक परिणामों पर कोई प्रभाव नहीं पड़ेगा।

7. वैधता: 6 महीने.