बोवाइन कोलेजनेज़ (कोलेजेनेज़) एलिसा

किट अनुदेश पुस्तिका

यह अभिकर्मक केवल अनुसंधान उद्देश्य के लिए है: इस किट का उपयोग गोजातीय सीरम, प्लाज्मा और संबंधित तरल नमूनों में कोलेजनेज़ की सामग्री निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

प्रायोगिक सिद्धांत:

यह किट नमूने में गोजातीय कोलेजनेज़ के स्तर को निर्धारित करने के लिए डबल एंटीबॉडी सैंडविच विधि का उपयोग करती है। एक ठोस-चरण एंटीबॉडी बनाने के लिए शुद्ध गोजातीय कोलेजनेज़ (कोलेजेनेज़) एंटीबॉडी के साथ माइक्रोप्लेट को कोट करें, बदले में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-लेपित माइक्रोवेल्स में कोलेजनेज़ (कोलेजेनेज़) जोड़ें, और फिर एचआरपी लेबल वाले कोलेजनेज़ एंटीबॉडी के साथ मिलकर एक एंटीबॉडी-एंटीजन-एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स बनाएं, और पूरी तरह से धोने के बाद, रंग विकास के लिए सब्सट्रेट टीएमबी जोड़ा जाता है। टीएमबी एचआरपी एंजाइम के उत्प्रेरण के तहत नीले रंग में और एसिड की कार्रवाई के तहत अंतिम पीले रंग में परिवर्तित हो जाता है। रंग की गहराई नमूने में कोलेजनेज़ के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है। अवशोषण (ओडी मान) को 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ मापा गया था, और नमूने में गोजातीय कोलेजनेज़ (कोलेजेनेज़) की एकाग्रता की गणना एक मानक वक्र द्वारा की गई थी।

किट संरचना:

किट रचना

48 छेद विन्यास

96-अच्छी तरह से विन्यास

बचाना

निर्देश

1 सर्विंग

1 सर्विंग

सीलिंग फिल्म

2 टुकड़े (48)

2 टुकड़े (96)

सीलबंद बैग

1

1

एंजाइम लेपित प्लेट

1×48

1×96

2-8 ℃ पर स्टोर करें

मानक उत्पाद: 360ng/ml

0.5 मिली × 1 बोतल

0.5 मिली × 1 बोतल

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मानक तनुकरण

1.5 मिली × 1 बोतल

1.5 मिली × 1 बोतल

2-8 ℃ पर स्टोर करें

एंजाइम अभिकर्मक

3 मिली × 1 बोतल

6 मिली × 1 बोतल

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नमूना मंदक

3 मिली × 1 बोतल

6 मिली × 1 बोतल

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डेवलपर एक तरल

3 मिली × 1 बोतल

6 मिली × 1 बोतल

2-8 ℃ पर स्टोर करें

डेवलपर बी तरल

3 मिली × 1 बोतल

6 मिली × 1 बोतल

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समाधान रोकें

3 मिली × 1 बोतल

6 मिली × 1 बोतल

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सांद्रित धुलाई तरल

(20 मिली × 20 बार) × 1 बोतल

(20मिली × 30 बार) × 1 बोतल

2-8 ℃ पर स्टोर करें

नमूना प्रसंस्करण और आवश्यकताएँ:

1. सीरम: कमरे के तापमान पर रक्त प्राकृतिक रूप से 10-20 मिनट के लिए जमा होता है, लगभग 20 मिनट (2000-3000 आरपीएम) के लिए सेंट्रीफ्यूज होता है। यदि भंडारण के दौरान कोई अवक्षेप दिखाई देता है तो सतह पर तैरनेवाला को सावधानीपूर्वक एकत्र करें और फिर से अपकेंद्रित्र करें।

2. प्लाज्मा: ईडीटीए या सोडियम साइट्रेट को नमूने की आवश्यकताओं के अनुसार थक्कारोधी के रूप में चुना जाना चाहिए, 10-20 मिनट के लिए मिश्रित किया जाना चाहिए, और लगभग 20 मिनट (2000-3000 आरपीएम) के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए। सतह पर तैरनेवाला सावधानी से इकट्ठा करें। यदि भंडारण के दौरान कोई अवक्षेप बनता है, तो इसे फिर से सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए।

3. मूत्र: एक बाँझ ट्यूब में एकत्र किया गया और लगभग 20 मिनट (2000-3000 आरपीएम) के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया। सतह पर तैरनेवाला सावधानी से इकट्ठा करें। यदि भंडारण के दौरान कोई अवक्षेप बनता है, तो दोबारा सेंट्रीफ्यूज करें। फुफ्फुस और जलोदर, मस्तिष्कमेरु द्रव संदर्भ कार्यान्वयन।

4. सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला: स्रावित घटकों का पता लगाते समय, एक बाँझ ट्यूब के साथ इकट्ठा करें। लगभग 20 मिनट (2000-3000 आरपीएम) के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला सावधानी से इकट्ठा करें। कोशिकाओं के अंदर घटकों का पता लगाने पर, पीबीएस (PH7.2-7.4) के साथ सेल सस्पेंशन को पतला करें, और सेल एकाग्रता लगभग 1 मिलियन / एमएल तक पहुंच जाएगी। बार-बार जमने और पिघलने से कोशिकाएं नष्ट हो जाती हैं और अंतःकोशिकीय घटक निकल जाते हैं। लगभग 20 मिनट (2000-3000 आरपीएम) के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला सावधानी से इकट्ठा करें। यदि भंडारण के दौरान कोई अवक्षेप बनता है, तो इसे फिर से सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए।

5. नमूने को व्यवस्थित करें: नमूने को काटने के बाद उसका वजन करें। पीबीएस, PH7.4 की एक निश्चित मात्रा जोड़ें। बाद में उपयोग के लिए तुरंत फ्रीज करें और तरल नाइट्रोजन के साथ बचाकर रखें। नमूना पिघलने के बाद, यह अभी भी 2-8 डिग्री सेल्सियस का तापमान बनाए रखता है। एक निश्चित मात्रा में पीबीएस (PH7.4) जोड़ें और एक मैनुअल या होमोजेनाइज़र के साथ नमूने को समरूप बनाएं। लगभग 20 मिनट (2000-3000 आरपीएम) के लिए सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला सावधानी से इकट्ठा करें। अंशांकन के बाद, एक हिस्से का परीक्षण किया जाना है, और बाकी को भविष्य में उपयोग के लिए फ्रीज कर दिया गया है।

6. नमूना संग्रह के बाद यथाशीघ्र निकाला जाना चाहिए। निष्कर्षण प्रासंगिक साहित्य के अनुसार किया जाना चाहिए। प्रयोग निष्कर्षण के बाद यथाशीघ्र किया जाना चाहिए। यदि परीक्षण तुरंत नहीं किया जा सकता है, तो नमूने को -20 ℃ पर संग्रहित किया जा सकता है, लेकिन बार-बार जमने और पिघलने से बचना चाहिए।

7. NaN3 युक्त नमूने का पता नहीं लगाया जा सकता क्योंकि NaN3 हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP) की गतिविधि को रोकता है।

कदम:

1. मानक उत्पादों का पतलापन और लोडिंग: एंजाइम-लेपित प्लेट पर 10 मानक कुएं सेट करें, पहले और दूसरे कुएं में 100 μl मानक उत्पाद डालें, और फिर पहले और दूसरे कुएं में 50 μl पतला मानक उत्पाद डालें, अच्छी तरह मिलाएं; फिर पहले कुएं और दूसरे कुएं से 100μl लें और उन्हें क्रमशः तीसरे और चौथे कुएं में डालें, और फिर क्रमशः तीसरे और चौथे कुएं में 50μl मानक मंदक डालें, अच्छी तरह मिलाएं; फिर तीसरे और चौथे कुएं में से प्रत्येक में 50μl लें और इसे त्याग दें, फिर पांचवें और छठे कुएं में प्रत्येक में 50μl डालें, और फिर क्रमशः पांचवें और छठे कुएं में 50ul मानक कमजोर पड़ने वाला घोल डालें और अच्छी तरह मिलाएं; मिश्रण के बाद, पांचवें और छठे कुएं से 50μl लें और उन्हें क्रमशः सातवें और आठवें कुएं में जोड़ें। फिर क्रमशः सातवें और आठवें कुएं में 50μl मानक तनुकरण घोल डालें। आठ कुओं से 50μl लें और उन्हें नौवें और दसवें कुओं में जोड़ें। फिर नौवें और दसवें कुएं में 50μl मानक तनुकरण घोल डालें। मिश्रण के बाद, नौवें और दसवें कुएं से 50μl लें और त्यागें। (पतला करने के बाद, प्रत्येक कुएं की मात्रा 50μl है, और सांद्रता 240ng / ml, 160ng / ml, 80ng / ml, 40ng / ml, 20ng / ml हैं)।

2. नमूने जोड़ें: रिक्त कुओं की स्थापना करें (रिक्त नियंत्रण कुओं में नमूने और एंजाइम अभिकर्मक नहीं जोड़े जाते हैं, बाकी चरण समान हैं) और परीक्षण किए जाने वाले नमूना कुओं की स्थापना करें। एंजाइम-लेपित प्लेट के परीक्षण नमूने में 40μl नमूना पतला जोड़ें, और फिर परीक्षण किए जाने वाले नमूने का 10μl जोड़ें (नमूने का अंतिम पतलापन 5 गुना है)। नमूना जोड़ें और नमूने को माइक्रोप्लेट के कुएं के नीचे जोड़ें, कोशिश करें कि कुएं की दीवार को न छुएं, मिश्रण करने के लिए धीरे से हिलाएं।

3. इनक्यूबेशन: प्लेट को सीलिंग प्लेट से सील करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

4. मिश्रण मिश्रण: आसुत जल के साथ 30 गुना (48T का 20 गुना) सांद्रित वाशिंग तरल को पतला करें और फिर उपयोग करें।

5. धुलाई: सीलिंग फिल्म को सावधानी से छीलें, तरल को हटा दें, घुमाकर सुखाएं, प्रत्येक कुएं को धोने वाले तरल से भरें, इसे 30 सेकंड तक खड़े रहने दें और फिर हटा दें, इसे 5 बार दोहराएं, थपथपाकर सुखाएं।

6. एंजाइम जोड़ें: खाली कुएं को छोड़कर, प्रत्येक कुएं में 50μl एंजाइम लेबल अभिकर्मक जोड़ें।

7. इन्क्यूबेशन: ऑपरेशन 3 के समान है।

8. धुलाई: ऑपरेशन 5 के समान है।

9. रंग विकास: प्रत्येक कुएं में 50μl डेवलपर ए जोड़ें, फिर 50μl डेवलपर बी जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और 15 मिनट के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करें।

10. समाप्ति: प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में 50μl स्टॉप सॉल्यूशन मिलाएं (इस समय नीला रंग पीला हो जाएगा)।

11. निर्धारण: शून्य और 450 एनएम तरंग दैर्ध्य पर खाली एयर कंडीशनर के साथ अनुक्रम में प्रत्येक कुएं के अवशोषण (ओडी मान) को मापें। स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ने के 15 मिनट के भीतर माप किया जाना चाहिए।

सावधानियां:

1. प्रशीतित वातावरण से बाहर निकालने से पहले किट को 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित किया जाना चाहिए। यदि एंजाइम लेबल लेपित प्लेट खुली हुई है, तो पट्टी को एक सीलबंद बैग में संग्रहित किया जाना चाहिए।

2. क्रिस्टल सांद्रित वाशिंग तरल में अवक्षेपित हो सकते हैं, जिन्हें गर्म किया जा सकता है और तनुकरण के दौरान पानी के स्नान में घोला जा सकता है, और धोने के दौरान परिणाम प्रभावित नहीं होंगे।

3. नमूना जोड़ने के प्रत्येक चरण में सैंपलर का उपयोग किया जाना चाहिए, और परीक्षण त्रुटियों से बचने के लिए सटीकता की नियमित जांच की जानी चाहिए। नमूना लेने के समय को 5 मिनट के भीतर नियंत्रित करना सबसे अच्छा है। यदि कई नमूने हैं, तो नमूने जोड़ने के लिए वॉली गन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

4. कृपया प्रत्येक माप के एक ही समय में एक मानक वक्र बनाएं, दोहरा छेद बनाना सबसे अच्छा है। यदि नमूने में परीक्षण पदार्थ की सामग्री बहुत अधिक है (नमूने का OD मान मानक कुएं के पहले कुएं के OD मान से अधिक है), तो कृपया पहले इसे नमूना मंदक के एक निश्चित गुणक (n बार) के साथ पतला करें और फिर इसे निर्धारित करें। गणना करते समय, कृपया कुल तनुकरण गुणक (× n × 5) से गुणा करें।

5. क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए सीलिंग फिल्म एक बार उपयोग तक सीमित है।

6. कृपया सब्सट्रेट को प्रकाश से दूर रखें।

7. निर्देशों का सख्ती से पालन करें, और परीक्षण के परिणाम माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा निर्धारित किए जाने चाहिए।

8. सभी नमूनों, धोने वाले तरल पदार्थों और विभिन्न अपशिष्टों को संक्रामक एजेंट के रूप में माना जाना चाहिए।

9. इस अभिकर्मक के विभिन्न बैचों के घटकों को मिश्रित नहीं किया जाएगा।

10. यदि अंग्रेजी मैनुअल से कोई मतभेद हो तो अंग्रेजी मैनुअल मान्य होगा।

गणना:

मानक की सांद्रता को भुज और OD मान को कोटि के रूप में लेते हुए,

नमूने के OD के अनुसार, निर्देशांक कागज पर एक मानक वक्र बनाएं

मान मानक वक्र द्वारा निर्धारित होता है; फिर तनुकरण द्वारा गुणा किया जाता है

एकाधिक; या मानक की सांद्रता और OD मान का उपयोग करके मानक की गणना करें

अर्ध-वक्र का रैखिक प्रतिगमन समीकरण, नमूने का OD मान

समीकरण में स्थानापन्न करें, नमूना सांद्रता की गणना करें, और तनुकरण से गुणा करें

गुणक नमूने की वास्तविक सांद्रता है।

(यह चित्र केवल सन्दर्भ के लिए है)

किट प्रदर्शन:

1. नमूने के रैखिक प्रतिगमन और अपेक्षित एकाग्रता के बीच सहसंबंध गुणांक आर 0.95 से ऊपर है।

2. बैच और अनुमोदन क्रमशः 9% और 11% से कम होगा

परीक्षा रेंज:

5एनजी/एमएल -300एनजी/एमएल

भंडारण की स्थिति और वैधता अवधि:

1. किट को स्टोर करें: 2-8 ℃।

2. वैधता: 6 महीने